微生物实验报告模板（精选10篇）
随着社会不断地进步，报告对我们来说并不陌生，要注意报告在写作时具有一定的格式。我们应当如何写报告呢？以下是小编收集整理的微生物实验报告模板，欢迎大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
微生物实验报告 1
实验目的：
（1）了解培养基的配置原理和方法，掌握分离培养微生物的有关准备工作。
（2）掌握高压灭菌方法及原理
实验原理：
（1）培养基的制备原理：
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
从营养角度分析：
营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分和无机盐等；适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力；一定的氧化还原电位；合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反复融化，其凝固性降低。
（2）湿热灭菌原理——高压蒸汽灭菌
在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
实验材料与方法
配制培养基所需器材
实验设备：高压蒸汽灭菌器。
实验器材：500ml三角烧瓶、蓝盖瓶、5ml刻度吸管、培养基、天平、砝码、称量纸、药勺、500ml、100ml量筒、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐、平皿、剪刀等。
培养基等集中放讲台前高压桶内，送到洗刷室统一高压灭菌条件及注意事项
高压灭菌条件：121.3℃，15min。含糖培养基113℃，15min。
倒平板电炉加热灭菌好的培养基打开平皿包装倒平板（10块）
注意事项：空气环境无菌（应在酒精灯火焰周围无菌区）。
a.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。
b.瓶口要过火焰。
c.左手掀开平皿小口。
d.倾注满皿底再多一点，约10ml（7cm直径平皿）。
e.推放一边要轻缓，不能晃起琼脂挂壁，易在培养过程中污染杂菌。
f.完全凝固再翻转平板放塑料筐内，4℃备用。
分析与讨论
（1）如何证明培养基灭菌是否彻底？
把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的`结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
（2）为什么说消毒与灭菌是微生物学和临床医学必不可少的基本知识？由于病原生物广泛存在于自然界，可通过不同途径和媒介进入人体，引起感染或造成疾病流行。因此，杀灭或清除存在于体外传播媒介上的病原生物，对于切断传播途径、预防和控制其感染具有重要意义。自古以来，人们就利用煮沸、火烧、日晒等方法杀灭或去除微生物，达到预防疾病的目的。实际上，除了在临床医疗实践中需要防止微生物的污染或感染外，在微生物学实验室、食物保存、饮水净化、药品与生物制品生产等过程中都需要避免微生物的污染。
微生物实验报告 2
实验目的与要求：
掌握霉菌与酵母菌的接种与培养方法。
实验原理：
接种是微生物实验及科学研究中一项基本操作技术。根据实验目的和要求，选择合适的接种工具与接种方法，接种工具有接种环、接种针、接种铲、接种钩、吸管、滴管、棉签等。常用接种方法有：斜面接种，液体接种，穿刺接种，平板接种和固体接种。接种的关键是无菌操作。
无菌操作的原则：在酒精灯火焰旁进行，所有器皿均须严格消毒，培养基应事先做无菌试验，接种工具使用前后须经火焰烧灼灭菌，棉塞不能乱放，始终夹在手指中。在培养四大类微生物时应注意选择适宜的培养条件。多数细菌为专性需氧菌与兼性需氧菌，少数为厌氧菌。多数食品腐败菌和工业用菌种，以及人和动物病原菌的最适生长温度为37℃，并且在近中性（PH6.5～7.5）条件下生长良好。多数放线菌为好氧菌，少数为厌氧菌，最适生长温度为28～30℃，多数适宜在偏碱性环境中生长（PH7.5～8.5）。
实验材料与方法
（1）实验材料：实验设备：温箱。
实验器材：毛霉、曲霉、青霉、根霉、啤酒酵母、白假丝酵母、新生隐球酵母菌、细黄链霉菌、PDA平板、高盐察氏平板、高氏合成I号平板、塑料筐、20%甘油水溶液、镊子、接种铲、无菌盖玻片、无菌滤纸、无菌载玻片、石棉网、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐等。
（2）实验方法：平板接种：毛霉→PDA平板（点植法）
啤酒酵母→PDA平板（五区分离划线法）青霉、曲霉→PDA平板（连续划线法）
小室载玻片培养法：
1、取灭菌后小室平皿。
2、取无菌PDA琼脂薄层平板，用镊子夹住盖玻片切割成0.5～1.0cm2的琼脂块，并将其移至培养小室中的载玻片上，制作过程注意无菌。
3、用接种环取少量霉菌的孢子接种于培养基四周，用无菌镊子
将盖玻片覆盖在琼脂块上，并灭菌的20%甘油（用于保持湿度），盖上皿盖，标记，置28～30℃培养3～5d
粮食产品的平板接种：
1.取粮食样品20g，放入无菌烧杯，加无菌水洗涤，反复10次，弃去水后，将粮粒倒于平皿内备用
2.镊子取粮食种入PDA琼脂内，每皿可接种5-10粒。
放线菌的接种：取细黄链霉菌划线法接种，在接种的划线处，无菌操作斜插入盖玻片数张。
注意事项：
1.空气环境无菌（应在酒精灯火焰周围无菌区）
2.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。
3.接种环使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可。
4.接种环使用后，先在火焰周围把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。
5.金属杆快速通过火焰2－3次，杀灭表面微生物
分析与讨论
1、粮食中产毒真菌的种类及产生毒素？
青霉、毛霉、曲霉、根霉、酵母、白念、细黄链霉菌（放线菌）青霉素、丝生毛霉素、黄曲霉素、根霉素、白念菌素。细黄链菌素
2、常用霉菌培养基有哪些？
马铃薯蔗糖培养基
豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基察氏培养基
3、霉菌的.接种方法有何不同？为什么？
（1）连续划线法（青霉、曲霉）
青霉与曲霉为局限性生长的霉菌。应采用连续划线接种法接种。
（2）点植法（根霉、毛霉）
根霉与毛霉生长区域比较大，应采用点植法。
（3）小室载玻片培养法（青霉、毛霉、根霉、曲霉）
实验三霉菌的制片与形态观察
实验目的：学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；
了解四类常见霉菌的基本形态特征。了解放线菌的基本形态特征。
实验原理：霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3-10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉兰具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。
实验材料：
（一）菌种：在马铃薯琼脂平板上培养3—4天的青霉(Penicilliumsp.)、曲霉(Aspergillussp.)、毛霉（Mucorsp.）、根霉；
（二）器材及用具：镊子、载玻片、盖玻片、显微镜。
实验方法：
（一）直接制片观察
于洁净载玻片上，用镊子取霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝，然后小心地盖上盖玻片。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜
（二）小室培养观察
将载玻片直接放低倍镜下观察，再换高倍镜观察。
观察原则：
毛霉：用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等。用高倍镜观察孢子囊孢子的形状、大小。
根霉：菌丝、孢子同毛霉，注意观察有无假根。
曲霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位置，辨认分生孢
子梗、顶囊、小梗和分生孢子。
青霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生孢子的形状等。
实验结果：
分析与讨论：
青霉和曲霉的形态有哪些异同？
青霉常分布在霉腐变质的水果、蔬菜、粮食和皮革等物体上，菌体直立菌丝的顶端长有扫帚状的结构，结构的每一个分枝上，生有成串的孢子，成熟的孢子呈青绿色，进行孢子生殖。
曲霉广泛分布在谷物、空气和土壤中，曲霉直立菌丝的顶端膨大成球状，球状结构的表面放射状地生有成串的孢子，孢子随曲霉种类的不同而呈黄色、橙色或黑色。
从皮肤取材查真菌如何检查？
微生物实验报告 3
实验名称：
用高倍显微镜观察叶绿体和细胞质流动
一、实验目的
1.初步掌握高倍显微镜的使用方法。
2.观察高等植物的叶绿体在细胞质基质中的形态和分布
二、实验原理
高等植物的叶绿体呈椭球状，在不同的光照条件下，叶绿体可以运动，改变椭球体的方向，这样既能接受较多的光照，又不至于被强光灼伤。在强光下，叶绿体以其椭球体的侧面朝向光源；在弱光下，叶绿体以其椭球体的正面朝向光源。
因此，在不同光照条件下采集的葫芦藓，其小叶内叶绿体椭球体的形状不完全一样。活细胞中的.细胞质处于不断的流动状态，观察细胞质的流动，可以用细胞质基质中的.叶绿体的运动做为标志。
三、材料用具
藓类的叶，新鲜的黑藻，显微镜，载玻片，盖玻片，滴管，镊子，刀片，培养皿，铅笔
四、实验过程（见书Ｐ30）
1．制作藓类叶片的临时装片
2．用显微镜观察叶绿体
3．制作黑藻叶片临时装片
4．用显微镜观察细胞质流动
物理实验报告 ·化学实验报告 ·生物实验报告 ·实验报告格式 ·实验报告模板
五、讨论
1．细胞质基质中的叶绿体是否静止不动，为什么？
2．叶绿体的形态和分布与叶绿体的功能有什么关系？
3．植物细胞的细胞质处于不断的流动状态，这对于活细胞完成生命活动有什么意义？
4．用铅笔画一个叶片细胞，标出叶绿体的大致流动方向。
微生物实验报告 4
实验名称：
观察洋葱表皮细胞。
实验目的：
1、学习制作洋葱表皮玻片标本。
2、学会使用显微镜观察洋葱表皮，用图画记录观察到的洋葱表皮细胞。
3、对比用肉眼、放大镜、显微镜看到的洋葱表皮各有什么不同。
实验重点：
用显微镜观察洋葱表皮细胞。
实验难点：
正确使用显微镜。
实验准备：
分组实验器材：显微镜、洋葱、小刀、清水、滴管、吸水纸、载玻片、盖玻片、镊子、放大镜等。
实验过程：
一、导入课题
出示洋葱。问：如果从它的内表皮上揭下一块，用显微镜来观察能看到些什么呢？（板书课题）
二、制作洋葱表皮玻片标本
1、师讲解并演示制作洋葱表皮玻片标本的方法与步骤。
（1）在一个干净的玻璃载片中间滴一滴清水；
（2）用小刀在洋葱鳞叶片内壁划一个“井”字，用镊子取下“井”中洋葱内表皮放到载玻片的水滴中央，注意标本要平展开，不能折叠；
（3）用盖玻片倾斜着盖到标本上面，放盖玻片时，先放一端，再慢慢放下另一端，注意不要有气泡。如水不足，可沿盖玻片边缘滴加；若水分过多，可用吸水纸吸掉；
（4）从盖玻片的一边滴一滴稀释的碘酒，并把玻片微微倾斜，再在盖玻片的另一边用吸水纸吸掉多余的水；
（5）洋葱表皮玻片标本做成可进行观察。
2、学生以组为单位自制玻片标本（最好制三份装片，便于下面的对比观察），教师巡视指导（教育学生注意安全）。
三、观察洋葱表皮细胞
1、先用肉眼观察洋葱表皮将看到的`内容画在科学记录本上。
2、再用放大镜观察洋葱表皮将看到的内容画到科学记录本上。
3、学生交流用肉眼和放大镜分别观察到什么？它们有何不同？
4、利用显微镜观察洋葱表皮细胞。
（1）出示显微镜，引导学生认识显微镜，简介各部分的名称、功能及使用方法，学生每5人一组操作熟悉显微镜。
（2）各组利用显微镜观察洋葱表皮细胞。
（3）学生观察、记录、描画洋葱表皮细胞。教师巡视指导，各组的实验组长监督组员操作是否规范，要求每个人都要操作、都要观察，并将观察结果进行交流。组长将大家在显微镜下的发现画到科学记录本上。
5、全班交流在显微镜下的发现。
（1）各组推荐发言代表谈自己的.发现。
（2）各组将所画的观察结果向全班展示。
（3）交流讨论评价。
6、师小结：我们发现放大镜比肉眼、显微镜比放大镜看到的细节更多，更清楚。我们发现洋葱表皮是由一个个比较规则的多边形组成的，而且大多呈长方形，外为细胞壁，内为无色细胞质和细胞核。洋葱表皮上的一个个小房间似的结构，就是洋葱的细胞。（师一边描述一边画洋葱细胞简图）
四、实验结束。
回收实验器材，整理实验桌。
微生物实验报告 5
一、实验名称：
用显微镜观察洋葱表皮细胞
二、实验材料：
显微镜、洋葱表皮细胞切片，及其他细胞装片。
三、实验步骤：
1、右手握住镜臂，左手托住镜座，把显微镜向着光放在实验台上。
2、对光：转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。
3、调节载物台下的反光镜，从目镜往下看，能看见亮的光圈。
4、观察：调节粗准焦螺旋，把所要观察的洋葱表皮切片放在载物台上，用压片夹夹住，标本要正对通光孔的中央。
5、左眼向目镜内看，同时转动粗准焦螺旋等，直到看清切片上的细胞为止，最后整理器材。
四、使用注意事项：
1、取送显微镜时，应右手握住镜臂，左手托住镜座，轻拿轻放。
2、镜检时，坐姿端正，一般用左眼观察物象，用右眼看着实验报告纸画图。两眼须同时睁开。
3、切忌一面从目镜进行观察，一面使镜筒下降，这样容易使物镜与玻片标本碰撞而损坏。
4、在高倍镜下调节焦距时，切勿使用粗调节器，以免压坏标本，损坏物镜。
5、显微镜使用完毕必须先上升镜筒，移开镜头后再取出玻片标本，以免取玻片时擦损镜头的镜面。
五、实验原理：
利用教学显微镜观察洋葱表皮细胞。
六、创新点：
在实验过程中为学生提供多种细胞装片，以供学生操作、观察，增加了学生动手实验的时间，使学生在实验中经历调节显微镜的.焦距的过程，从而熟练掌握教学教学显微镜的使用方法。
微生物实验报告 6
一、实验目的
通过本次实验，我们希望深入了解微生物的基本特性，掌握微生物的分离、培养与观察方法，为进一步研究微生物的应用打下基础。
二、实验原理
微生物是一类个体微小、结构简单的生物，包括细菌、真菌、病毒等。本实验主要利用微生物的繁殖特性，通过选择适当的培养基，将微生物分离出来并进行培养。通过显微镜观察，我们可以了解微生物的形态、大小、染色反应等特性。
三、实验步骤
实验准备：选择合适的培养基，如肉汤培养基、琼脂培养基等；准备显微镜、接种环、灭菌锅等实验器材。
灭菌处理：将培养基和实验器材进行高压蒸汽灭菌，以消除杂菌干扰。
微生物分离：从样本中提取微生物，采用稀释法或划线法将微生物接种到培养基上。
培养与观察：将接种后的培养基放置在恒温箱中，在适宜的温度和湿度条件下进行培养。定期观察微生物的生长情况，记录生长特点。
显微镜观察：选择生长良好的菌落，用接种环取少量菌体，置于显微镜下观察其形态、大小及染色反应等特性。
数据记录与整理：详细记录实验数据，包括微生物的形态特征、生长情况等。整理数据并进行分析。
四、实验结果与分析
经过实验，我们成功分离并培养了多种微生物，包括细菌、真菌等。通过显微镜观察，我们记录了各种微生物的形态特征，并对其进行了初步分类。以下是部分实验结果的数据表格和图表记录。
五、结论
通过本次实验，我们掌握了微生物的'分离、培养与观察方法，了解了不同微生物的形态特征和生长特性。这些知识对于进一步研究微生物的应用具有重要意义。在未来的研究中，我们可以利用这些知识探索微生物在生物工程、环境保护等领域的应用价值。同时，本实验也提高了我们的实践操作能力和科学探究精神。
微生物实验报告 7
一、实验目的：
1、学会如何使用显微镜观察细胞；
2、了解细胞的结构；
3、学会制作临时装片。
二、实验材料：
（实验材料可换）松针、动物血液、动物神经细胞永久装片
三、实验用具：
载玻片、盖玻片、蒸馏水、滴管、镊子、土豆、刀片、显微镜（物镜5X、10X、40X）
四、方法步骤：
1、制作松针的临时切片：
（1）取干净的载玻片一个平置于试验台上，用滴管在载玻片中央滴一滴蒸馏水。
（2）将土豆切成条状（截面约：0.5X0.5cm)取两条，将一根松针夹在两个土豆条之间，用刀片削成尽量薄的薄片，削时，手腕不动，靠大臂带动小臂移动刀片。切片数次。从中选取较薄的切片，置于载玻片的水滴上。
（3）从一侧轻轻盖上盖玻片，不要产生气泡。用吸水纸轻轻吸去盖玻片周围的水滴，即完成临时切片的制作。
2、观察切片：
（1）取出显微镜，置于试验台上靠左的位置，打开光源。
（2) 将上步制作好的切片置于显微镜的载物台上，调整载物台位置，使盖玻片对准光源。
（3）使用5X物镜观察切片，使松针切片在视野中心，换成10X物镜，观察松针叶面横切结构。
（4）换成40X物镜观察，注意细胞及细胞内物质结构，画图。
3、动物血液临时装片的制作及观察（除了不用切片，其他类似）
4、 动物神经细胞永久装片的观察。
五、反思：
1、松针的叶面结构是什么样的？
2、动物细胞的结构是什么样的？与植物细胞又什么不同？
3、显微镜的'物镜倍数愈大，视野的亮度如何？物体的大小如何？
4、如何调节焦距？
5、如何才能使切片尽量的薄？切片的厚薄对显微镜下观察的效果有什么影响。
微生物实验报告 8
一、实验目的：
1、掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。
2、了解细胞凋亡的生物学意义
3、掌握凋亡细胞的形态学检测方法
二、实验原理：
1、细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。
2、细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的.、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。
3、凋亡细胞形态学特征是:体积变小，细胞质浓缩；细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化)；细胞膜有小泡状形成；晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体；根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。
三、实验步骤：
细胞中过氧化物酶的显示
1、在载片上滴一滴PBS缓冲液；
2、取骨髓细胞：用断颈法处死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，剪开股骨一端，用牙签尖的一端插入剪开的'小孔中，抠取少许骨髓细胞置滴有PBS的载片上；
3、涂片：用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开，室温晾干；
4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸铜液，以盖满涂片为宜，处理30秒-1分钟。
5、倾去硫酸铜液，直接滴入联苯胺混合液反应6分钟（以盖满涂片为宜）
6、清水冲洗，番红复染2min。
7、镜检：清水冲洗，室温晾干，先低倍镜下观察，后换高倍镜下观察（油镜100×）
细胞凋亡的形态学检测与观察吉姆萨染色:
1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)
2、生理盐水轻轻漂洗细胞
3、95%乙醇固定5min
4、PBS缓冲液洗2次
5、吉姆萨染色液染色5min
6、蒸馏水轻轻洗去染液
7、普通光学显微镜下观察。
吖啶橙染色:
1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)
2、生理盐水轻轻漂洗细胞
3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min
4、PBS缓冲液洗2次每次1min
5、0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min
6、蒸馏水轻轻洗去染液
6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。
四、结果与分析：
1、根据随机选择的几个视野的统计，该样品的细胞凋亡率=227/506×100=44.9
2、Hela细胞凋亡过程中核染色质的形态变化（吖啶橙染色）
五、思考题：
1、细胞凋亡的调控机制
细胞凋亡是一个受基因调控、众多细胞膜受体和胞浆蛋白参与的细胞主动自杀过程，其触发因素多种多样，包括细胞内诱导因子和抑制因子对细胞凋亡的调控。
2、细胞凋亡的特征
凋亡细胞形态学特征是:体积变小，细胞质浓缩；细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化)；细胞膜有小泡状形成；晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体。
3、研究细胞凋亡的方法
定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）
定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。
微生物实验报告 9
一、【实验目的】
1、掌握碱变性提取法提取大肠杆菌中质粒DNA的原理和方法。
2、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
3、学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
4、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】
1、质粒DNA的制备方法
质粒（Plasmid）是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA的制备包括3个步骤：
①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；
②收集和裂解细菌
③分离和纯化质粒DNA。主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。
2、质粒DNA的提取——碱变性提取法
在细菌细胞中，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用pH值4.6的KAc（NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
3、凝胶电泳进行DNA分离纯化
电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的'电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA的片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸（5—500bp）的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β—D—吡喃半乳糖与3，6—脱水—L—吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104—105。琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40—45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大（50至百万bp），小片段DNA（50—20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA的片段，进一步纯化DNA等。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。
三、【实验材料】
1、实验仪器
培养皿、接种环、三角瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、50ml离心管、1.5ml塑料离心管（Eppendorf管）、高速离心机、漩涡振荡器、微量移液器、不同型号枪头、天平、制胶槽、梳子、电泳仪、吸管、量筒、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、试剂瓶、卫生纸和记号笔、手套等。
2、实验试剂
LB培养基，抗生素Ap（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭（EB），DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5.2的醋酸钠。
四、【实验步骤】
1、准备实验
配制LB液体培养基，分装到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固体培养基；准备1000ul、200ul、10ul移液枪尖各一盒，1.5ml离心管若干于500ml三角瓶中，50ml离心管2个 ，将上述物品包好连同配好的培养基一同灭菌。
2、菌体培养
在含有Ap的LB平板上挑取一环携带有质粒pUC19的E。coli DH5单菌落，接种于20mlLB液体培养基中进行37℃振荡过夜培养，培养基中加Ap100ul
（100ug/ml），质粒pUC19具有Ap抗性基因，使得带有pUC19的质粒得以生长。 过夜培养后菌体量大，杂质较多，然后用移液枪吸取过夜培养物2ml转接于50mlLB液体培养基中，培养基中加入Ap250ul，37℃振荡培养4—6h至对数生长期后期，生长速率快，代谢旺盛，酶系活跃，杂质少，适合提取质粒。
3、质粒提取
（1）称量空的50ml离心管的重量为14.331g，然后将三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒满，液面距管口约1cm，7000rpm离心5分钟后弃去上清液，收集菌体细胞。
（2）向离心管中悬滴加入5ml冰预冷的溶液Ⅰ打散菌体洗涤，用漩涡振荡器使之充分悬浮后用枪尖吹吸混匀，同步骤（1）离心，弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液全部流尽干燥，然后称重得14.437g，则菌体质量为106mg。
（3）洗涤后每100mg菌体应加入冰预冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌体按100mg菌体处理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混匀，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使
溶液密度增加，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；维持渗透压，防止细胞提前破裂，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生长。Tris—Cl溶液提供适当的pH。
（4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（与溶液Ⅰ对应），轻加轻摇，冰浴5min。溶液变清亮透明粘稠如蛋清状。溶液Ⅱ中的NaOH使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化导致细胞溶解。同时，强碱性使染色体DNA、质粒DNA和蛋白质变性；SDS为下一步沉淀做铺垫。
（5）按比例加入冰预冷的溶液Ⅲ1.5ml（与溶液Ⅰ、Ⅱ对应），轻加轻摇，冰浴10min。溶液出现白色絮状沉淀。沉淀为蛋白质SDS复合物、细胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断基因组DNA，只要是50－100 kb大小的片断，就不能再被PDS共沉淀。同时变性的质粒DNA复性。反应形成的高盐环境进一步加速了沉淀。
（6）12000rpm离心15min，白色沉淀聚集在离心管一侧，用移液枪将上清液转移到另一洁净的离心管中。然后向上清液中加入1/10体积的3MNaAc混匀，加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。
（7） 以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，轻轻地覆盖沉淀，不打散沉淀，洗涤一次。
（8）以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。去掉上清液，将离心管上沉淀部位做好标记，将离心管倒置于吸水纸上，干燥5min。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，要在离心管上标记质粒所在位置。
（9）将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，移液枪吹吸助溶，然后将溶解液转移到一个Eppendorf管中。TE是pH缓冲液，为DNA提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。同时含有EDTA是二价阳离子的螯合剂，抑制DNA酶作用。
4、质粒纯化
（1）Eppendorf管中加入RNase A（纯浓度＞50ug/ml），37℃保温0.5—1h
（2）将上述的溶液平均分配到2个1.5ml的微量离心管中，每管0.5ml，分别加入与溶液等体积的（500ul）Tris饱和苯酚溶液，振荡混匀，7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中。苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。苯酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。
（3）加入等体积的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到到另一洁净的Eppendorf管中。苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。此时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但仍有蛋白质的存在。
（4）加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中，得上清液400ul。
（5）向上清液中加入1/10体积的NaAc混匀，再加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。
（6）以12000rpm，离心15min，弃去上清液，得到DNA沉淀，为白色。
（7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗涤。然后以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。
（8）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。用50ulTE溶解于1管中。
5、质粒检测
（1）称取0.4g的琼脂糖，置于一锥形瓶中，在三角瓶上标好液面位置，加入40ml的1×TAE电泳缓冲液，再加入5—10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。冷却至50℃左右，倒入制板槽制板。
（2）待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1×TAE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面2—3cm。取1μl加电泳载样液和3μl质粒样品于小纸片上，用移液枪混匀。
（3）电泳1h，观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。
（4） 把胶槽取出，小心滑出胶块，放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约5min。
（5）凝胶成像仪观察。
五、【注意事项】
（1）滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻加轻摇溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，否则会破坏质粒DNA。
（2）加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡， 防止染色体DNA断裂，应该上下颠倒离心管，使其混匀。
微生物实验报告 10
一、实验目的
（一）掌握一般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。
（二）掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。
（三）掌握学习用微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。
二、实验用品
（一）器材
量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、ph试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜
（二）试剂及材料
肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫水溶液、0.5%中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏
三、实验步骤
（一）培养基的制备
1、麦康凯培养基
（1）组成：蛋白胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10ml、0.5%中性红水溶液5ml、蒸馏水1000ml
（2）方法：将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调节ph至7.2。将琼脂加入600ml蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。将两液混合，分装于烧瓶内，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。待冷却至50~ 55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。
注：结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。
2、血清平板
（1）组成：营养琼脂、牛血清
（2）方法：将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却至45~50℃时，加入牛血清，并混匀，倾注平板。
注：不得将牛血清一并加入后再灭菌。
3、lb培养基
（1）组成：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g
（2）方法：在950ml蒸馏水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂和氯化钠，调节ph至7.4，加热熔化，分装于瓶中，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。待冷却至50~ 55℃时，倾注平板。
4、液体培养基（在lb培养基的基础上，装入大试剂瓶中，不加琼脂，不分装）
（二）病料取材
在病猪死亡后，首先用显微镜检查其末梢血液膜片中是否有炭疽杆菌存在，未发现，则立即用消毒的器械对其进行生理解剖，观察其病理特征现象，取出病猪的十二指肠、胃、肝脏三处的组织物，并注意组织的完整性，用储物袋密封保存。
（三）细菌粗培养
1、消毒灭菌：操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外焰对待用器械进行火焰灭菌。
2、接种
（1）在无菌操作台酒精灯旁打开用储物袋密封保存的病料，先左手持镊子右手持剪刀，把病料剪出一个小口。
（2）右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭开约20左右，然后将接种环前端插入小口旋转一下后，再用划线接种的方法接种到一个血清平板上。
（3）用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、部位等标记，并将平板倒放。
以此方法，分别接种十二指肠、胃粘膜、肝脏于血清平板上，各接种2个血清平板。
3、培养：将接种好的血清平板倒扣放入37℃培养箱中，反向培养24小时。注：划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落，且划线时接种环应尽量倾斜，以免划破培养基（后同）；待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。
（四）细菌纯培养
1、菌落特征判断
待粗培养的细菌培养24小时后，取出用放大镜观察记录单个小菌落的形态特征并用实验报告纸记录好，并在平板底部上做好观察标记，其形态特征包括大小、形状、菌落边缘、表面构造、隆起度、湿润度、透明度、颜色等。
2、取单个菌落进行革兰氏染色镜检
（1）取干净的载玻片，用记号笔在其一面做好正反面标记，再在载玻片另一面中央滴上一小滴蒸馏水。
（2）将接种环在火焰上灭菌，待冷却后，在酒精灯旁从标记的单个小菌落中取少许细菌置于蒸馏水中混匀（同时盖好平板倒扣置于一旁），用接种环涂成直径约1.5cm的菌膜，再在酒精灯火焰上方以钟摆速度通过固定好细菌，待冷却进行染色。
（3）先滴加草酸结晶紫溶液染色1~2min，再水洗；然后滴加革兰氏碘液溶液染色1~2min，再水洗；随后滴加95%的酒精脱色30~60s，再水洗；最后滴加稀释的品红进行复染30~60s，再水洗；待干燥或吸水纸吸干后镜检。
（4）将干燥的载玻片放在1000倍油镜下，滴加一滴松柏油进行镜检，观察其形态特征，判断细菌的种属。
3、细菌接种培养
（1）消毒灭菌：操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外焰对待用器械进行火焰灭菌。
（2）接种：右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭开约20左右，然后将接种环插入揭开的平板口内蘸去一下镜检标记的小菌落，再用划线接种的方法接种到一个血清平板、lb平板或麦康凯平板上。并用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、菌种、部位等标记，将平板倒放。
（3）将接种好的'平板倒扣放入37℃培养箱中，反向培养24小时。
注：油镜用完后应立即清理物镜上的松柏油；划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落；待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。
（五）菌液的制备
1、镜检：用革兰氏染色法在1000倍油镜下镜检，观察并记录是否为纯培养的细菌。
2、分装液体培养基：先对无菌操作台及需要使用的器械进行消毒灭菌，然后用钳子揭开一个空试剂瓶，用倾倒的方法在酒精灯旁从液体培养基大试剂瓶中分装于空试剂瓶内，并立即盖上液体培养基大试剂瓶瓶塞。
3、接种：右手持接种环，用火焰对其进行灭菌，待冷却后，取出纯培养的平板，在无菌操作台内酒精灯旁，蘸去少许细菌，左手倾斜液体培养基，将接种环，伸入液体培养基内搅动，然后取出对接种火焰环灭菌，并用灭菌的包装纸捆绑好后，用记号笔做好相应标记，置于一旁。
4、培养摇菌：将接种好的液体培养基置于水浴培养箱中培养24小时。注：分装一个培养基就接种一个培养基，不得全部分装完后再一个一个接种。
（六）小鼠致病性实验
1、保定：选择健康的青壮年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋转数周让其眩晕，然后用左手的拇指和食指捏住两耳及头部皮肤，并翻转左手，使其头部朝下，以达到内脏前移的目的。
2、接种：先用酒精棉球蘸取酒精对注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取0.2ml菌液注射于小白鼠腹腔中。
3、观察：将接种的小白鼠放在适宜的环境下生活，并在鼠笼处用记号笔标记好接种时间、菌种等。
4、再培养鉴定：待小白鼠死亡后，对其进行解剖，观察其内脏病变情况，并取肝脏直接涂在相应培养基上，在适宜条件下反向培养24小时后，取菌落细菌进行镜检观察判断。
注：在注射小白鼠2小时候需要观察小白鼠是否因注射时伤害到内脏而死亡。
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