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生物样品的荧光观察
一、实验目的
1、初掌握荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜的结构、原理、使用方法及其在细胞生物学研究中的应用。
2、掌握生物材料的荧光染色和活体荧光蛋白的观察方法。
3、了解激光共聚焦的原理。
二、实验原理
1、某些物质经短波光照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量除部分转换为热量外，相当一部分则以波长较长的光能辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。细胞内的某些物质经过短波光照射后，可以发出自发荧光。在生物学研究中，能将发荧光的有机化合物-荧光染料与特定的细胞组分相结合，通过激发后产生的荧光对细胞组分进行定性和定位。
2、生物样品的荧光观察采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。荧光显微镜以波长较短的光为光源，照射被检样品，激发被检物品内的荧光物质发出可见的荧光，通过物镜和目镜放大成像。激光共聚焦显微镜也是来观察样品中荧光分布状况的。激光共聚焦显微镜是以激光为光源，在某一瞬间只用很小一部分光照明，通过检测器的一个小孔或裂缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，而来自焦平面外的散光则被小孔和裂缝挡住，成像异常清晰。此外，激光共聚焦显微镜可以在同一样品的不同焦平面进行扫描得到不同焦平面的图像，然后通过计算机重构出样品的三维结构。
3、本实验中微丝的荧光观察采用荧光素标记的鬼笔环肽（phalloidin），鬼笔环肽可以专一的结合在聚合状态的肌动蛋白丝上，起到稳定微丝的作用。细胞核的观察用DAPI（diamidino-2-phenylindole）染色。DAPI能与DNA双螺旋的凹槽部分相互作用，从而与DNA双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰358nm，而散射峰是461nm。而植物细胞的花粉管、筛板和胞间连丝含有胼胝质成分，经苯胺蓝染色后，用紫外光激发，可以发出黄绿色荧光。
4、激光共聚焦扫描显微镜（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）原理：用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描(转载于:www.hnNscy.CoM:生物荧光)激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
三、实验材料、试剂和仪器
1、材料：烟草悬浮细胞、拟南芥、蚕豆
2、试剂：3.6%多聚甲醛、Pipes缓冲液、100nmAlexaFluo488phalloidin、DAPI染色液、0.1%苯胺蓝
3、仪器：Olympus荧光显微镜、恒温培养箱、移液器、载玻片、盖玻片、镊子
四、实验内容
（一）荧光标记观察烟草悬浮细胞微丝骨架的分布
1、烟草悬浮细胞继代培养。
MS培养基的基本成分：
MS无机盐+KH2PO4200mg/L；烟酸10mg/L；维生素B11mg/L；
肌醇100mg/L；2，4-D0.1mg/L；蔗糖30g/L
在室温、黑暗生长，120~130rpm
2、固定：取300μl细胞液放入离心管中，静置沉降，3000rpm离心30s，吸出培养基，加入500μl3.6%多聚甲醛，固定20min。再吸出固定液，用Pipes缓冲液清洗三次，每次5min。
3、染色：3000rpm离心1min，吸净缓冲液，加入100nmAlexaFluo488phalloidin50μl，37℃染色20min，洗去染色液，加入50μl缓冲液，吸取10μl直接进行封片。
4、荧光显微镜观察：在蓝光激发下进行观察，检测的发射光波长为510-530nm。
（二）DAPI染色检测细胞核DNA
用镊子夹住三朵不同发育时期的拟南芥的花，将花粉黏在载玻片上，加入20ulDAPI染色液染色3-5min。在紫外激发下用荧光显微镜观察，检测发射光为461nm。
（三）、苯胺蓝染色观察胞间连丝
撕取蚕豆叶片下表皮，用20μl0.1%苯胺蓝染色3-5min后紫外激发下镜检。
五、实验结果
（一）荧光标记观察烟草悬浮细胞微丝骨架的分布
图1烟草悬浮细胞微丝骨架形态（phalloidin标记，Olympus荧光显微镜，40×物镜）
荧光显微镜下可以观察到，烟草悬浮细胞呈现出不规则形状，原因是培养之前去除了细胞壁。再培养一段时间后细胞壁再生，会有不同的形态。细胞中有一条绿色的丝状结构，即为微丝，细胞和附近颜色较深。微丝在细胞内呈现三维空间分布，细胞核附近分布较多，经查阅相关文献，解释为微丝在细胞内起到固定位置的作用。
（二）DAPI染色检测细胞核DNA
图2拟南芥花粉粒（DAPI染色，Olympus荧光显微镜，40×物镜）
A三细胞型花粉粒B两细胞型花粉粒
拟南芥的花粉粒呈微蓝色的透明状，细胞核被染成蓝绿色。一个细胞内可以观察到最多3个细胞核。
（三）、苯胺蓝染色观察胞间连丝
图3蚕豆叶下表皮细胞胞间连丝（苯胺蓝染色，Olympus荧光显微镜，40×物镜）
A胞间连丝B荧光标记淬灭后的观察效果
在紫外光激发的荧光显微镜下观察，发现胞间连丝位于相邻细胞之间的细胞壁上，呈现出绿色荧光。
六、分析与讨论
1、在荧光标记观察烟草悬浮细胞微丝骨架的分布实验中，在蓝光激发下，清晰的看到了发出绿色荧光的细胞骨架。同时，观察到制片的背景较明亮，原因可能是phalloidin
染色后清洗不够充分，导致残留的phalloidin粘在载玻片上，发出荧光。同时本次实验中在最后取样阶段细胞堆叠太多，导致微管组织显色重叠，观察不便。
2、在DAPI染色检测拟南芥花粉的实验中，看到部分花粉粒中都有三个明亮的发光点，判断为三个细胞核。此外，还看到一些仅有两个细胞核的花粉粒。我们知道成熟的拟南芥花粉为三细胞型。而两细胞的花粉粒可能是尚未成熟或在当前视野下只能看两个核。本实验中出现的三核并不明显，更多的是以双核为主，三核现象也更多时候第三核并不完整，总结原因估计是在取样阶段采集的是尚未展开的花朵。
3、在苯胺蓝染色观察胞间连丝的实验中，在紫外激发下，看到蚕豆下表皮细胞呈蓝色，其中较为明亮的光点即为胞间连丝。但在观察中，发现荧光很迅速的发生淬灭，给观察和拍照带来了很大困难。在本实验中选择两人配合以解决问题。但是，通过查阅相关资料后，建议在制片的时候，加入适量的抗淬灭剂如p-phenylenediamine(PPD)、0.2%DABCO，来减慢荧光的淬灭速度。
七、思考题
1、结合本实验，总结用于荧光观察样品的制备方法
根据生物样品产生荧光的方式不同，往往分为以下三类：
（1）自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的称为自发荧光或直接荧光。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光；在400nm左右的激发光照射下，可直接观察细胞壁纤维素所产生的绿色荧光等；一些具有GFP基因的生物编码出的蛋白能发出绿色荧光。
对于这类样品的观察，我们可以直接取材在荧光显微镜下观察，但要根据样品的荧光特性选取合适的激发光和发射光。
（2）次生荧光：有些生物组织经紫外光照射后，并不能发出荧光，但是它可以吸收某些荧光染料并与与之结合，也可以产生荧光，这种称为次生荧光（或间接荧光）。如鬼笔环肽、DAPI等。
该方法就是采用常用的荧光染料染色，也是本实验三种样品的荧光标记方法。首先应该根据样品选取能够与之特异性结合的荧光染料，比如鬼笔环肽结合微丝、DAPI结合核DNA、甲苯胺蓝结合胞间连丝的胼胝质。随后经染色处理，根据染料的特异性选取适当波长的激发光和发射光在荧光显微镜下进行观察。
（3）免疫荧光：这种染色法是利用抗原与抗体反应的原理，将荧光染料与抗体结合，然后将这种标记荧光染料的抗体再与相应抗原结合，即形成抗原、抗体复合物。经一定波长的光激发后，即可发射出荧光。以此辨认抗原在组织细胞内的分布状况。这种方法被称为免疫荧光或荧光抗体法。
该方法是一种更为间接地观察生物样品荧光的方法。其关键在于抗原-抗体反应的选取与设计。可以采用直接染色法，就是将荧光素直接与第一抗体结合，然后进行抗原-抗体反应；也可采用间接染色法，即将荧光素与第二抗体结合，此法需要进行两次抗原-抗体反应。观察时也需要注意调好光源，即选择适当的波长的激发光和发射光的选取。
此外，激光共聚焦扫描显微镜也可用来观察样品中荧光分布状况，其可以在同一样品的不同焦平面扫描得到图像，通过计算机重构出样品的三维结构，成像清晰，具有立体感。
参考文献
【1】翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学（第4版）.北京：高等教育出版社，2013
【2】王金发，何艳明，刘兵.细胞生物学实验教程（第2版）.北京：科学出版社，2011
【3】王幼群，陈立群，刘毅敏，杜中.细胞生物学实验教程.中国农业生物学生物学院细胞生物学教研组，2009
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