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真核细胞rna提取的实验报告
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一．原理
本方法利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，采用有机溶剂抽提去除蛋白质。通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。
二．方法
1.样品处理
⑴组织样品处理：取新鲜的组织样品称重后，剪碎成约1cm2的组织块直接加入匀浆液中进行RNA提取，或液氮中速冻-70℃保存。
⑵贴壁培养细胞处理：用PBS洗细胞一次，吸干溶液后将培养板快速移至液氮中冷冻后转到-70℃保存；或加入1ml匀浆至培养板中直接裂解细胞，然后将粘稠的裂解液进一步匀浆。
⑶悬浮培养细胞处理：离心收集细胞，用PHS悬浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，则可经液氮速冻后转至一70℃贮存备用。
2．加l倍体积盐酸胍匀浆液[至准备好的样品细胞中，高速匀浆1min。
3．匀浆液5000g，室温离心10min。
4．将上清移至一个干净离心管中，加入0.1体积的3mol／L乙酸钠（PH5.2），混匀，再加5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20℃放置至少2小时。
5．5000g0℃离心10分钟沉淀核酸，弃上清液，室温干燥。
6，每个提取RNA的组织或细胞样品中，加入l0～15min盐酸胍匀浆液Ⅱ，搅拌溶解。
7．加入2.5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20℃至少放置2小时。
8．5000g0℃离心10分钟沉淀核酸，去上清，室温挥发乙醇。
9．按每克组织细胞加5min的比例．分两次加入0.02mol／LEDTA(pH8.0)先加1／2体积EDTA振荡l～2分钟，3000g离心2min．吸出上清．再加另一个1/2体积的EDTA振荡l一2分钟．合并两次核酸溶解液。．
10．用等体积氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室温离心l0min，5000g室温离心10min。吸出上清至另一个干净离心管中。
11．加3倍体积lmol／L乙酸钠(PH7.0)混匀，-20℃放置1h以上，此时RNA将选择地沉淀，而DNA仍为溶解状况。
12．5000g，0℃离心20min，沉于管底的是RNA。
13．吸去上清，用4℃预冷的lmol／L乙酸钠(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃5000g，离心20分钟。回收RNA。
14．尽量去除上清液。按每g组织细胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／LEDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉淀析出．滴加0.11mol／LNaOH调溶液pH至7．5。
15．加入2倍体积冰预冷乙醇混匀，0℃放置至少2小时，5000g，4℃离心10分钟，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暂离心后，弃上清，室温干燥蒸发乙醇。
16．用适当小容积DEPC处理过的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍体积乙醇，
-70℃保存RNA备用。用时．加入0.1体积的3mol／L乙酸钠，混匀，120xxg，4℃离心回收RNA。
三.试剂
1．盐酸胍匀浆液Ⅰ
成分：8mol／L盐酸胍(分子量为95.6)，O．1mol／L乙酸钠(pH5．2)，5mmol／L2—巯基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸钠
配制方法：取191g盐酸胍．加8.35m13mol／L乙酸钠(pH5．2)和6．25ml0．2mol／L2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混匀后加12．5ml10％十二烷基肌氨酸钠,振荡混匀溶解。
2．盐酸胍匀浆液Ⅱ
成分：8mol／L盐酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸钠(pH5．2),1mmol／L2
—琉基乙醇，20mmol／LEDTA(pH8.0)
配制方法：取191g盐酸胍，加日．35ml3mol／I。乙酸钠(pH5．2)和1．25ml0．2mol
／L2—巯基乙醇溶液中，再加入10ml0.5mol／LEDTA(pH8.0)。加水至250ml混匀。
3.乙醇
4.70％乙醇
5.氯仿—正丁醇(4：l，体积比)
6.4mol／L乙醇钠，pH7.0
7.3mol／L乙醇钠，pH5.2
8.RNA溶解液
成分：O．2％SDS．0.05mol／LEDTA,pH8.0
四、说明
提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。
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